來源：本站 作者：jiyuanbio 時間：2025/2/19

原理

1. 分散體系：將樣本充分稀釋并分配到多個獨立的反應(yīng)單元中，如基于油包水微滴生成技術(shù)的微滴式數(shù)字 PCR 會通過油包裹 PCR 體系形成無數(shù)個油包水微滴，每個微滴是一個獨立反應(yīng)單元；基于微流控技術(shù)的微流控芯片式數(shù)字 PCR 則利用微流控芯片裝置使 PCR 反應(yīng)體系準確快速地分散于芯片孔中。
2. PCR 擴增：在每個反應(yīng)單元中進行單獨、平行的 PCR 反應(yīng)，對目標核酸分子進行擴增。
3. 信號檢測：擴增結(jié)束后，對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析，有熒光信號的反應(yīng)器判讀為 “1”，沒有熒光信號的反應(yīng)器判讀為 “0”，從而將熒光模擬信號數(shù)字化，最終根據(jù)泊松分布原理以及陰 / 陽性反應(yīng)的比例，直接計算反應(yīng)體系中待檢靶分子的拷貝數(shù)濃度。

優(yōu)勢

1. 絕對定量：常規(guī) PCR 和實時熒光 PCR 定量檢測需已知拷貝數(shù)的標準 DNA 制定標準曲線，會因樣品測定條件差異造成 PCR 擴增效率不同，影響定量結(jié)果準確性。而數(shù)字 PCR 不受標準曲線和擴增動力學影響，可直接讀出 DNA 的分子個數(shù)，實現(xiàn)絕對定量。
2. 高靈敏度：能檢測到極低拷貝數(shù)的核酸分子，原則上最低可檢測到 1 個拷貝的靶標分子，可有效區(qū)分與監(jiān)測微量濃度變化，能精確地檢測到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品，比如可以檢測出體細胞中含量極低的單個突變，能識別低至 1/100,000 的變異頻率1。
3. 高耐受性：目的序列被分配到多個微滴或反應(yīng)單元中，顯著降低了體系間的影響以及背景序列和抑制物對反應(yīng)的干擾，擴增基質(zhì)效應(yīng)大大減小，對樣品的純度要求相對沒那么苛刻，在檢測復(fù)雜樣本或含有抑制劑的樣本時更具優(yōu)勢。
4. 樣品需求量低：在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時具有明顯優(yōu)勢，只需少量的樣本即可進行檢測，能夠節(jié)約珍貴的生物樣本。
5. 可進行多重檢測：多個單一的反應(yīng)單元為多目標序列的高通量檢測提供了基礎(chǔ)，可同時對多個目標核酸分子進行檢測和分析，提高檢測效率和信息獲取量。
6. 結(jié)果準確性和重復(fù)性好：由于每個反應(yīng)單元獨立進行反應(yīng)和檢測，減少了反應(yīng)之間的干擾和誤差，使得檢測結(jié)果的準確性和重復(fù)性更高，不同批次實驗之間的差異也較小。